Ratno stanje na Jadranu započelo je već 27. lipnja 1991. godine sukobom JNA sa Slovenskom teritorijalnom obranom. Tada su brodovi Jadrolinije evakuirali oko 10.000 putnika, uglavnom stranaca s Jadrana. Najviše ih je prevezao trajekt Istra, i to u Trst, a pomagali su u tome i Ilirija te Marko Polo. Već 2. srpnja 1991. godine, poslovodstvo Jadrolinije proglašava radnu obvezu za sve pomorce i ostale djelatnike na kopnu. Uslijedile su pomorske blokade tijekom kojih su brodovi Jadrolinije nerijetko obavljali zadatke za Hrvatsku vojsku, a uspostavljene su i svakodnevne veze sjevera i juga Jadrana. Također, mnoge Jadrolinijine posade nisu poštovale zabranu plovidbe izdanu od strane JRM te bi danju bi mirovali u lukama, a potom noću, bez brodskih svjetla, održavali vezu s otocima.
Učestali su i zračni napadi na trajektne luke i mostove, no Jadrolinijine posade unatoč opasnim uvjetima održavaju vezu s otocima, a padom Masleničkog mosta postaju i jedina veza Dalmacije s ostatkom Hrvatske.
Dana 1. listopada 1991. godine, drevni grad Dubrovnik napadnut je s kopna, mora i iz zraka, a već 17. rujna Jugoslavenska ratna mornarica uvodi potpunu pomorsku blokadu grada. Nakon što je presječena Jadranska magistrala, jedina veza Dubrovnika s ostatkom Hrvatske bila je plovidba Jadrolinijinih brodova. Dubrovnik je bio bez vode, struje, hrane i lijekova, a u gradu se nalazilo oko 50.000 stanovnika i izbjeglica iz susjednih mjesta. Težnja za pomoći razorenom Dubrovniku kulminirala je u spontanom organiziranju poznatog konvoja Libertas, predvođenog Jadrolinijinom Slavijom. Konvoj je na svojem putovanju pristao u Zadru, Šibeniku, Splitu i Korčuli, postepeno rastući svaki put zahvaljujući pridruživanju mnoštva manjih brodica. Konvoj je 31. listopada uplovio u Gruž donoseći svjetlost nade i slobode zarobljenom Dubrovniku.
Od akcija Jadrolinije u Domovinskom ratu ističe se i uloga u napadu na Split. U rano jutro 15. studenog 1991. s brodova JRM smještenih u Splitskom i Bračkom kanalu napadnut je Split. Poslije borbi, 16. studenog 1991. Hrvatska ratna mornarica izborila je svoju najveću pobjedu u Domovinskom ratu. Njome je započelo postepeno oslobađanje obale i otoka, a jugoslavenska se ratna mornarica se morala povući na otoke Vis i Lastovo te u Boku kotorsku. Agresoru su tijekom napada meta bili i bijeli brodovi Jadrolinije. Više granata ispaljeno je prema trajektnoj luci Split. U napadu agresora na trajektnu luku pogođeni su trajekti Bartol Kašić i Vladimir Nazor.
Ratu je odgovoreno na jedini mogući način i onako kako je Jadrolinija znala – ploveći blokadama usprkos. Najveću su cijenu platila desetorica poginulih pomoraca. Oko osamdeset djelatnika Jadrolinije otišlo je na bojišnicu. Više je brodova oštećeno, a potpuno su izgubljeni trajekti Klimno, Supetar i Kačjak te brod Perast. Osim na brodovima i trajektima, mnogi pomorci i djelatnici Jadrolinije sudjelovali su u obrani Domovine u postrojbama HV. Uloga Jadrolinije u Domovinskom ratu vrednovana je brojnim priznanjima i odličjima, a 1991. godine primljena je i Vjesnikova Plava vrpca za hrabrost.